厭氧菌的分離和培養(yǎng)淺談

1 目的  

1.1 了解厭氧微生物的生長特性  

1.2 觀察厭氧微生物（雙歧桿菌）的形態(tài)特征  1.3 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養(yǎng)與計數(shù)技術(shù)  2 原理  

目前培養(yǎng)厭氧微生物的簡便而又有效的技術(shù)包括有：厭氧箱培養(yǎng)技術(shù)；厭氧罐培養(yǎng)技術(shù)；厭氧袋培養(yǎng)技術(shù)；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。這里介紹的是亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。  

亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美G微生物學(xué)家亨蓋特（Hungate）于1950年**提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù)。以后這項(xiàng)技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趣完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。而且多年來的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴(yán)格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。  

亨蓋特厭樣滾管培養(yǎng)技術(shù)不僅可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離、與活菌培養(yǎng)計數(shù)，還可以用于有害腐敗菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭狀芽孢桿菌）的分離與鑒定。  3 材料  3.1 樣品  

雙歧酸奶（液體）、雙歧桿菌制劑（固體）。  3.2 培養(yǎng)基  

改良MRS培養(yǎng)基，PTYG培養(yǎng)基。  3.3 儀器和器具  

亨蓋特厭氧滾管裝置一套，厭氧管，厭氧瓶，滾管機(jī)，定量加樣器。  4 流程  

銅柱除氧→預(yù)還原培養(yǎng)基→稀釋用液制備→稀釋樣品→滾管→培養(yǎng)→計數(shù)  5 方法  

5.1銅柱系統(tǒng)除氧  

銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40—400mm，兩段被加工成漏斗裝，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故當(dāng)這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏?。?dāng)向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的氧就結(jié)合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色。此銅柱可以反復(fù)使用，并不斷起到除氧的目的。當(dāng)然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。  5.2 預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備  

制作預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液時，先將配制好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5-5ml，稀釋液裝9ml，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍(lán)到紅**后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。  5.3 雙歧桿菌樣品不同稀釋度的制備  

在無菌條件下準(zhǔn)確稱取1g固體或用無菌注射器吸取1ml混合均勻的液體樣品，而后加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其震蕩均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1ml 10-1稀釋液**另一支裝有9ml生理鹽水的試管中，制成10-2稀釋液。按此操作方法依次進(jìn)行10倍系列稀釋**10-7，制成不同濃度的樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進(jìn)行滾管培養(yǎng)計數(shù)。  5.4厭氧滾管培養(yǎng)法  

將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養(yǎng)基試管放置于50℃左右的恒溫水浴中，用1ml無菌注射器分別吸取10-5、10-6、10-7三個稀釋度的稀釋液各0.1ml于融化了的瓊脂培養(yǎng)基試管中，而后將其平放于盛有冰塊的盤中或特制的滾管機(jī)上迅速滾動，這樣帶菌的融化培養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層。每個稀釋度重復(fù)3次，而后置于37℃（酸奶樣品42℃）恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)24—48小時后，即可在厭氧管的瓊脂層內(nèi)或表面長出肉眼可見的菌落。  5.5 雙歧桿菌活菌（分離）計數(shù)  

選擇分散均勻，數(shù)量在幾十~幾百個菌落的厭氧試管進(jìn)行活菌計數(shù)，即可得出每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量。  5.6 計算雙歧桿菌的活菌數(shù)量cfu/g(ml)樣品=0.1ml滾管計數(shù)的實(shí)際平均值×10×稀釋倍數(shù)  6 結(jié)果  

6.1 觀察雙歧桿菌形態(tài)，描述其形態(tài)特征。  

6.2 計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量，記錄結(jié)果。